Dharmacon公司的siRNA使用指南!_林中客_新浪博客

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Dharmacon公司的siRNA使用指南！ (2008-04-10 23:08:41)转载▼ 今天刚拿到的，全是英文，怕做实验中用到万一理解不正确，所以译了部分，供使用相同公司的朋友共享，仅供参考，自己也没较对！2 -ACE合成的RNA寡核苷酸参考指南应用RNA寡聚物1.接收RNA 此RNA低聚物是通过2-ACE保护来运输。 其它的所有保护基已经从RNA裂解.除非有其他方面的要求,所有核苷酸内结合是磷酸盐并且5\'-和3\'末端都是羟基。保护核糖核酸的2\'-ACE的一般结构如下: 此2\'-保护基共同抵抗核酸酶降解和促进最小化二级结构。Dharmacon在装运前利用阴离子交换HPLC（高压液相色谱法）分析研究0.5%等分每个2\'保护低聚物。剩下的99.5%等分原始低聚物在真空中干燥，包装并装入为稳定的2\'-保护形式以最佳保证匀质性。2\'-保护基在pH 3.8下利用含水的缓冲液（enclosed aqueous buffer）下30分钟内很容易除去。 收到RNA 低聚物后必须存储在-20°C备用。随每个样品低聚物的说明书可以取出并放入笔记本中供参考。2.使用前准备 利用含水缓冲液（aqueousbuffers ）小于30分钟2\'-保护基可被完全除去。 (见讨论机制的附件C)此亲水性的2\'-ACE 保证任何序列或者2\'-保护的RNA 长度是水溶性的。每个低聚物伴随有一个易挥发的脱保护缓冲液和2\'-脱保护规程。此规程被设计成能保证所有2\'-羟基全部的脱保护。(注意:此2\'-脱保护受到pH、时间和温度的综合影响，这些因素的许多的变化,包括缓冲液是可以改变的，如果随后的应用或者利用可取的考虑选择的条件,请联络Dharmacon研究人员以讨论特殊需要。) 全部的一批RNA 可以2\'脱保护备用，换句话说,仅需要什么时再选择去保护并且剩余部分储存在-20°C.这将保证任何不用的RNA 长期的稳定。 因此已经分装的每个RNA低聚物被分成多管的,并且可以更进一步地随意分成小的等分。仅仅等分随意地在无菌水二次溶解RNA ,并且脱水到干燥。此规程因此须根据脱保护缓冲液的数值成比例校准。[如果要求另外的缓冲液请联络Dharmacon。换句话说,缓冲液可利用以下规程产生：醋酸(2.86ml ,0.050moles ，100mM溶液)首先加入无菌水(496ml )中，加入50-100微升等分的tetramethlethylenediamine(TEMED四甲基乙二胺？？)校准pH 到3.80. 通常总共要求800-900微升的TEMED.] 2\'-脱保护后,RNA置于100mM Acetate -TEMED（四甲基乙二胺醋酸盐）缓冲液,pH 3.8.此缓冲液可能被冷冻脱水干燥或者通过利用Speed-Vac（真空离心蒸发浓缩器） 以保证没有产物丢失。标准脱盐技术,例如乙醇沉淀法,反向脱盐盒或者凝胶过滤(例如G25sephadex)可以使用但会引起某些产物损失。 如果RNA脱保护后被立即纯化，可用加样缓冲液直接装入HPLC（高压液相色谱？？）或者聚丙烯酰胺凝胶。3.效果 平均分段的结合产物是 99%。因此全长产物micromoles（微摩尔？）产量可通过增加合成比例到0.99^(oligolength -1)来估计。利用每个说明书上提供的低聚物的分子量可计算milligrams （毫克）产量。利用1ODU260=33微克转换比可以估计OD260单位(ODU260)产量。换句话说附件B表可用来对照获得预计产量。4.纯化 合成后原始的RNA 低聚物是HPLC 分析研究并且除去溶剂以备装运。合成和装运之间没有另外的处理。许多研究人员报道应用原始的RNA足以完全使用不需更进一步地纯化。 (请注意原始的RNA 和DNA低聚物有一样高或者更高的质量。）如果要求更大的均质性或者认为必需的则推荐脱盐或者纯化。 此RNA低聚物可以通过PAGE 或者阴离子交换HPLC 纯化，2\'-保护或者2\'-羟基RNA两者都可以通过PAGE 或者阴离子交换HPLC 纯化。siRNA用户指南 Dharmacon:Dharmacon目前提供三个siRNA选择用于委托合成siRNA低聚物。(Dharmacon同样提供大量合成前siRNA二倍体。) 选择A提供水溶性、稳定的、2\'保护RNA,收到以后在含水缓冲液中去保护。 2\'-保护作用确保RNA使用以前不降解。双RNA低聚物可以在相同的作用下同时2\'-去保护和退火更进一步地预防抵抗降解。SiRNA 二倍体能通过乙醇沉淀法直接从含水2\'-脱保护/退火作用而脱盐。脱保护和退火后,RNA小粒于400 l缓冲液。为了乙醇沉淀,通过添加26 l 5MNaCl校准溶液到0.3MNaCl，最后加入1500 l纯的乙醇和vortex（旋转）。 样品在干冰或者-20°C培育1到2小时，离心收集RNA 小粒。除去所有液体并且在200-400 l无菌水中再溶解，通过紫外光谱学(1个260-单位相当于32 gRNA)确定浓度并且继续退火(见下文)。 应该注意原始RNA产物85%完全长度以上,使siRNAs 凝胶纯化以用于敲低没有必要。选择b提供此核糖核酸彻底地去保护,脱盐和等分在50纳摩数量。再溶解此舰核糖核酸小粒水中和继续sirna退火(见下文)。选择C提供纯度 97%的纯化的二倍体siRNAs 。水中再溶解此装运的RNA二倍体并且继续直接用于转染(见下文)。此最后选择保证二倍体合适形式并且准备好转染。